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    北京pk赛车正规网站:徕卡显微镜荧光观察法

    2013-10-16  发布者:admin 

    荧光观察法在医学领域有着广泛的用途,如免疫学研究的对象是抗原和抗体的反应问题,由于抗体反应的高度特异性,所以当抗原体发生反应时,只要知道其中一个因子,也就可以知道另一个因子。
    但是这个过程必须通过染色,荧光染色剂就应运而生。
    由于荧光染色的色素只需极稀的浓度便能使激发出明亮的荧光。因而,染色后不会破坏抗体(或抗原)原有的特异活性。
    其光学原理示意图如下,以蓝光激发为例:

    荧光激发光学原理图

    激发滤光片                                     荧光本                       截止滤光片

     

    光源发出多种波长的光线,经激发滤光片后只能通过某种单色的激发光,荧光标本在激发光作用下,激发出某种特定的颜色光(荧光)。由于被激发的荧光能量很弱,只能在黑暗的背景才易于观察
    到,所以增加了抑制滤光片使残余的激发光不能通过。
    早期的荧光观察采用透射照明,它有很大的缺陷,当激发光透过标本组织时,很大部分的光线被衰减掉,到达我们需观察的标本上表面时,只能激发出微弱的荧光。
    近代的荧光观察采用落射照明,如下图所示:

    荧光落射照明图中 :
    1.光源
    2. 激发滤光片
    3. 物镜
    4. 标本
    5. 二向性分光镜
    6. 抑制滤光片
    7. 目镜

     

     

     

     

     

     

    A> 光源
    根据不同的激发光需要,可以选用三种光源,卤素灯,高压汞灯和氙灯。下图列出菲利浦公司高压汞灯和氙灯的光谱特性曲线。

    高压汞灯的光谱特性曲线氙灯的光谱特性曲线

    高压汞灯的光谱特性曲线                          氙灯的光谱特性曲线

     

    由图知,高压汞灯是线状光谱,对于某些波长光线有很高的强度,它适用很多染色法。
    氙灯在300~800nm 波长内几乎可以看作连续光谱,虽然是某些波长的强度不如汞灯,但它适用于所有荧光染色法。
    卤素灯也是连续光谱,它在蓝光,绿光处也有较高的强度(但远低于汞灯,氙灯)因此,对于只用蓝光,绿光激发的简易荧光显微镜可以选用卤素灯。
    通常采用50W汞灯,100W 汞灯75W氙灯及100W 卤素灯作荧光光源。
    图中物镜既起成象作用,又起聚光镜作用。为了获得很好的观察效果,在荧光很微弱的场合如细菌发出的荧光。建议采用大数值孔径物镜,如徕卡的荧石物镜,平场复消色差物镜。
    正因为物镜又兼聚光镜作用,所以物镜中玻璃材料,透镜间胶合剂,以及浸油必须确保在激发光下不会自发荧光。
    为了使用方便,常将激发滤光片,二向性分光镜及抑制滤光片组合成一个???。对于不同的荧光染色法,必须选用合适的??椴拍艿玫铰獾慕峁?。所谓二向性分光镜对激发光具有高反射率,而对激发出的荧光具有高透过率。

    B> 常用荧光???/span>
    一般荧光??橛腥缦滤闹郑?br /> 近紫外光激发??楱D―UV、 紫光激发??楱D―V、 蓝光激发??楱D―B、 绿光激发??楱D―G
    这些??槎杂ψ挪煌旧?,如B ??槌S肍ITC 染色法,G ??槌S寐薮锩鰾200 染色法。
    必须特别指出,激发光的波段曲线绝对不能与抑制光的波段曲线部分重迭,否则,视场中的背景
    光全部是激发光的颜色,而微弱的荧光完全被掩盖住,正如白天天空中无法看到星光一样。

    激发光的颜色激发光的颜色

    1─激发光 2─抑制光

     

    蓝光激发如用FITC 染色法,它的激发波段为480~490nm,被激发的荧光波长为510nm。由图知,无论激发光或抑制光在500 nm 处均截止,无相交重迭。所以,残留的激发光无法通过截止滤光
    片,视场背景是黑暗的,而荧光则可顺利地透过截止滤光片,形成荧光图像。
    徕卡公司设置了许多???,供不同的染色法选用:

    滤光片??榇?/span>

    激发光范围

    激发滤光片

    二向性分光镜

    截止滤光片

    A

    紫外光

    BP340-380

    RKP400

    LP425

    D

    紫外光+紫光

    BP355-425

    RKP455

    LP470

    E4

    蓝光

    BP436/7

    RKP455

    LP470

    H3

    蓝光

    BP420-490

    RKP510

    LP515

    I3

    蓝光

    BP450-490

    RKP510

    LP515

    K3

    蓝光

    BP470-490

    RKP510

    LP515

    L4

    蓝光

    BP450-490

    RKP510

    BP515-560

    M2

    蓝光

    BP546/14

    RKP580

    LP590

    N2.1

    绿光

    BP515-560

    RKP580

    RKP580

    TX

    绿光

    BP530-595

    RKP600

    LP615

    G/R

    绿光

    BP490/20

    RKP505

    BP525/20

    蓝光/绿光

    BP575/30

    RKP600

    BP635/40

    B/G/R

    紫外光/蓝光/绿

    BP400/20

    RKP415

    BP530/30

    BP495/15

    RKP510

    BP640/40

    BP570/30

    RKP590

    BP610/75

    注意:
    许多荧光标本无法长期保存,特别在激发光照射下,荧光很快消失。所以,在停止观察时,应该将激发光挡。但是汞灯开启到熄灭后,第二次再启动时,必须待灯源冷却后才能进行。为此,须在??榍吧柚靡坏舶澹⊿hutter),可随时关闭、开启。

    荧光显微镜 荧光“激发 发射”??? width=

                                               荧光“激发 / 发射”???/span>

                                                                                                                                            

     

    标本图像

    标本图像(蓝光激发)                                              标本图像(紫外光激发)

     

    标本图像(绿光激发) 标本图像(蓝光+紫外光激发)

    标本图像(绿光激发)                                      标本图像(蓝光+紫外光激发)



    沪公网安备 31011202003519号

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