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    pk10精准计划软件手机:徕卡显微镜共振振镜扫描仪智能控制

    2014-08-02  发布者:admin 

    高时间分辨率显微镜 (HTRCLSM),需要快速扫描设备。而非共振振镜扫描器允许充分的位置控制,但只是在速度较慢,共振扫描仪允许 ~ 25,000 行每秒,但提供更少定位自由。仍然允许缩放和平移功能,几种方法都试过,有不同程度的成功。徕卡共聚焦显微镜 TCS 系列的使用是非常聪明的解决方案,使与开关时间短的无级缩放。

    图: © MNStudio — — Fotolia.com

     

    "生物学是一门自然科学与生命和生物有机体的研究有关"是生物学的维基百科条目的介绍性的句子。而显微镜在旧天主要有关死对象 (虽然以前还活着),生物显微镜的最终目的是,想象生活物体。虽然小生物样品往往看起来处于非活动状态,微观的角度揭示了活跃的活动。细菌有快速移动的鞭毛、 细胞和组织代谢产物显示速度非??斓谋浠?、 小泡运输,非凡的速度和电气信号播出由毫秒范围动作电位。为了遵循这些活动,我们必须有高的帧速率。共焦显微镜在早期的解决方法是引入并行化技术,例如旋转盘系统,但他们缺乏真正的共焦层析性能。单点扫描器提供最佳光学切片的性能,但通常被认为慢。采用谐振振镜扫描器,现代技术可以达到帧速率在每秒 500 的范围。这篇文章显示了如何克服这些器件的限制了。

    振镜扫描器 — — 用激光光绘画

    扫描灯现货在一个二维的地区,这束光的角度,改变。这项任务是通过偏转束的束路径中插入镜子很容易解决的。要扫描,镜像必须是可旋转。黄金标准的旋转镜是采用什么叫做"振镜扫描器"。这些设备有一直在广泛激光投影仪的激光表演和电影放映。

    "检流计"一词起源于电学计量。测量电流,线圈被插入到一个磁场。一根针的线圈旋转轴上安装。当电流通过线圈,洛仑兹力导致挠度的针。较高电流,更广泛反对重置挠度力量。挠度可校准的测量电流。

    另一方面: 如果当前已知的一个人可以创建所需的挠度。为光指向应用程序 (扫描仪),针被交换的一面镜子。当一束光打镜子时,反射角的改变由两次的旋转角度。

    用于精确定位,旋转角度解码通过位置传感器,安装在旋转杆的另一面。一个反馈系统控制的驱动电流,以保证的挠度是总是确切地在所需的角度。这允许控制的扫描速度和静态定位中所有可用的 xy 平面上的点。这些扫描程序被称为"闭环"已关闭的反馈制度。在成像的应用,一种重要的模式是锯齿扫描。线扫描所需的速度是由执行移动在一个方向 ("x") 现货线性在时间在所要求的速度。然后,若要重复扫描,镜子被搬回最大速度的起始角度。这种模式是可能的慢线频率作为正弦扫描的替代方法。二维扫描 — — 标准的应用程序 — — 由垂直地引入第二个扫描仪的梁路径生成。这第二个 ("y") 扫描仪生成增量中第二个轴。显然,y 扫描仪 (标准条件下) 的速度是 x 扫描仪相比要慢得多,因此,具有更少的限制。

    在 ca.500 Hz 线频率和 512 × 512 像素的全帧,帧速率达到约一秒。与固定的样品,这是足够的时间分辨率,给出了极大的信噪比。另一方面,当成像快速移动的物体,帧速率每秒 100 以上期望的 (最好是大约每秒 500)。如果这些图像是有 10 行,每个框架 ("地带扫描"),则需要一个扫描仪,可以生成每秒 5,000 线。

    虽然扫描仪和扫描镜轻质物料制成,都是尽可能的小,他们都是机械设备,发挥显著的惯性。因此,更高的速度他们只能执行正弦扫描。在极端情况下,扫描仪有发达的扫描仅在正弦波模式下,只有在它们的共振频率。像秋千,这些设备只能改变其振幅 (通过饲养更多的能量) 和他们的阶段,与外部标准句号的位置。目前,与 12,000 赫兹频率谐振振镜扫描器是可用的。当数据记录在两个期间提出和背部训练 (双向成像),线频率的成像可以达到 24,000,对应 ~ 45 全帧每秒,对同频的最现代的运动图片正在使用。在黑暗的一面,这些共振扫描仪有没有控制的位置和扫描频率。这种扫描仪提供电磁抽头的反馈,但这是不太准确要的任何使用。Galvo scanners, as used in Leica true confocal scanners (TCS), are derivatives of galvanometers, metrology devices that have been used to measure electrical parameters. Initially, these devices were equipped with rotating coils, with a pointer mounted on the rotation axis. A more advanced version used a mirror mounted on the axis, and collimated light that was reflected by the mirror on a screen (flying spot method). Such devices resemble the principle of a galvo scanner, which points laser light into a specified direction that is controlled by the applied current.

    图 1: 最初,灵敏电流计测量电流可以在磁场中旋转线圈设计。左: 在流动的电流通过线圈,洛伦兹力倾斜线圈,并固定在旋转轴的针。倾斜取决于当前,其中可以进行校准。
    右: 一个更精确的版本被配备安装于而不是针轴上一面镜子。后照准直的光 (最好的情况: 激光灯) 到镜子上偏转可以监视 (飞行现货方法) 的屏幕上。
    已知的电流应用时,可以控制挠度。一程序的当前列火车将导致现场时空运动模式。这是振镜扫描器的工作原理。

     

    视场 — — 一个更好的选择,比缩放因子

    显微镜有圆形光学。当你在显微镜下看,你看到的是一个圆。多少您的示例,您可以观察到在一个给定的放大是由指定字段数 FN (Sehfeldzahl,SFZ),这是直径的毫米在目镜 (中间图像平面) 的外地平面中的图像。如果使用带有字段编号 25 40 x 镜头和目镜,然后你可以观察到的实际面积是 625 µ m 的直径圆。当然,镜头有充分纠正来处理这样一个大的领域,如果体面成像是物镜,而通常该字段局限的共焦扫描以确保足够的图像质量。扫描图像是通常正方形或矩形。如果扫描的全部字段指定 (例如上述 SFZ 25),然后矩形的对角线相等的字段编号,和一个 40 x 镜头会给作为对角线 625 µ m。如果扫描一个正方形,边缘对应于 442 µ m × 442 µ m。

    而不是扫描的全部领域,它是非常简单的只是通过减少振幅 (伸长率) 的振镜扫描器扫描它只有一小部分。如果扫描振幅是一半,只有一半各自的维度记录。正方形的面积然后对应于四分之一的全视场扫描。

    仍然,像素数是相同的和当一个监视器上显示,显示器的尺寸不会不改变的当然。从本质上说,更小的扫描已由两个因素生成额外的放大倍数。这额外的放大倍数是无级可调,称为"扫描缩放"。它不通过光学元件,并应因此不混淆与光学变焦的安排。这是不是变体中显示记录的像素数据,它应该不会混淆与显示的缩放选项,要么。事实上,扫描变焦是一个机械变焦控制的扫描装置的力学性能 (尽管这是电力驱动和控制电子和电算化)。

    正对减少扫描振幅,直到它达到零没有限制,扫描缩放可以提供无限的放大倍数。不过: 像与目镜的放大倍数在普通显微镜下,有定义当扫描缩放跨越地平线上的有意义的使用规则。这些规则取决于分辨率及放大倍数的镜头,并记录每个维度的像素的数目。成像,20 倍以上的扫描缩放很少需要。较高的缩放因子仅用于激光操作,例如漂白或活化。

    为不同的制造商使用不同的字段编号,扫描缩放的绝对值不是可比较的。另外混淆营办商,一些使用缩放因素甚至比一个小。一个更合理的值将实际使用的字段数,只是通过计算扫描区域的对角线和乘以这由物镜的放大倍数。与这一指标,它是甚至可能比较在不同光放大倍数 (不同物镜) 的表现。

    不扫描时全 (光学) 字段,一个人可以自由选择字段的哪些部分进行扫描。此函数称为"淘金",需要在扫描偏移量的编程,即扫描程序运行不对称。这只是可供闭环扫描仪。共振扫描仪需要不同的解决方案为平移。

    The Leica TCS SP8 and TCS SP8 STED 3X use amplitude control for zooming and scan offset for panning. Zoom controls the scanned field size and should be indicated as the change in field number FN.

    图 2: 顶部: 光学的视野充分利用由方形扫描,触及中间图像字段的限制。大小对应于正方形的对角线 (与直径的圆形领域 (虚线圆圈) 通常表明作为字段编号 FN.通常情况下,最大扫描的区域是略低光场数相同,因此我们将调用它 FN0要与之比较放大扫描。
    中东: 如果扫描振幅降低,例如由因子为 3 这两个维度,然后使用的领域也是原场直径的 1/3。光学分辨率仍维持不变,扫描分辨率增加,这是有效放大。此操作类似于对原始领域 (1 x 放大) 3 倍变焦。为适当的比较,这应显示的 FN,这里 FN = FN0/ 3。
    底部: 缩放的扫描启动时的中点,扫描的区域可以移动内光场。这称为泛函数 (平移)。

     

    如何纠正虚假的移动

    正如前面提到的在扫描时的速率限制元素是 x 振镜。如果没有空闲的时间,所需的追述,和扫描仪可以操作在一个完美的锯齿波,则每个像素的时间将是 1/f * x,与正在扫描频率 f 和 x 的像素数。为真正的扫描仪,这是没有完全达到,回缩的时间是有限的以及机械的延伸,"物镜"被削掉,正如他们所显示的非线性。更高的速度,可编程扫描仪操作在正弦波模式下,也可能是最慢的速度,当然。共振扫描仪只能扫描正弦规律变化。

    如果扫描正弦,然后空间-时间的关系不再是线性的。作为图像扭曲是不可以接受,强度有等距的记录 x 和 y,对应于 inequidistant 记录的时间。因此,数据记录 (像素) 在一条线的开始时间是线的密度扫描仪快的线中间并且在,两端相距越来越远,扫描速度为零在结束和开始朝着相反的方向前进。不是完全适当的但可能解决这个问题将使用只有正中为正弦波,近似呈线性。但是然后一会失去 90%的可用的扫描时间,(虽然激光是的所有的时间),将需要在更大的振幅,反过来会减慢振镜扫描器扫描。因此,一个使用一个较大的分数,例如 80%的一列火车 (这在双向模式中操作时,给出了一个时间周期的 60%) 和适用的非线形的像素时钟。这个非线性像素时钟容易获得闭环扫描仪,因为它们提供了使用位置解码供外部使用。非线性像素时代的第二个作用是每个像素的录制时间也是位置相关的事实。如果一个员工强度电流转换为标准的电荷放大器,像素将会更明亮的边缘。此外,噪音较少的边缘与中心的扫描。对于正常成像,这不是一个问题。依赖噪声的方法,如栅格图像相关,会遭受这种记录,由于噪声也是短像素高和低的长像素为单位)。在这里,就必须确保不断整合时代整个扫描区域 (这是最大的中心的短像素长度)。高频率采样和 intrapixel 积累,介绍了共焦显微术 Leica TCS SP5 允许的每个像素的位置及速度的积分时间控制。

    图 3: 左: 当扫描正弦和录音数据与统一的像素时钟 dt,信号将会来自非等距点在样本中,并因此会扭曲图像。在中心,该图像将会扩大由于扫描仪的速度更快的速度 (每时间距离: dsC).在边缘,图像就会受到挤压由于扫描仪的速度慢 (每时间距离: dsE).
    右: 为了获取数据在空间上等距点 ds,像素时钟已被编程为更长的时间的边缘 (dtE) 和更短的时间在中心 (dtC).

     

    一个行人的解决方案: 使用 Ronchi 光栅和砍光

    A 共振扫描仪不是可编程的速度,扫描偏移和缺乏精确位置读出。要仍雇用共振扫描仪与效益,这些缺点需要得到补偿。第一个可行的解决办法使用光学标尺中所述采样时钟是 1995 年由 R.Tsien 帕的共焦手册。这种方法利用定向到作为位置探针扫描镜的背面 (也是反射式的) 第二,低功耗的红色激光。反射的探测光通过光栅组成的透明和非透明条纹 (Ronchi 光栅),非常像尖桩篱栅。在光栅扫描探针光和光之后由一个光电二极管检测到。如尖桩篱栅是等距和扫描仪运动正弦波,调制光探针施加正弦脉冲长度与光明黑暗模式。这些模式的侧面可以用作一个像素时钟,然后是正弦波的时间,但在扫描的场空间等距。

    虽然这一概念解决了非线性像素时钟,它有它的局限性。像素为单位) 的最大数目被法治的网格光栅中的元素数。像素数只可能在整个数字分数在栅栏上的木条数目的切换。

    可用缩放因素取决于适当的光栅: 较高的缩放因子为同等像素数字需要较短 (和密度) 光栅。因此,那里是没有连续缩放的方式,不得不改变光栅的探针梁路径切换时缩放,其中。因此,一套的光栅光栅在存储库中 — — 通常是一个可旋转的圆盘必须可用。

    平移不是用这种机械参考测量可用的。

    • Optomechanical pixel clock generation for resonant scanners using a Ronchi grating

    图 4: 左: 谐振的扫描共焦光学机械像素时钟解码的示意图。用于成像、 激光针对通过分裂的镜子上扫描镜和激发荧光 (蓝色跟踪) 样品中。所发出的光 (绿色跟踪) 被 descanned 由扫描镜,劈裂的镜子所反映和转换成电子信号的探测器。辅助激光定向到扫描镜 (红色跟踪) 的后侧 (还反映)。它通过光栅导致二进制信号像素p从检测光电二极管。
    右: 提取的一整套的像素时钟通过追踪探测光 (反映在背侧的扫描镜,x') 结束组成的固定数量的不透明和透明的等距条纹网格。该传感器将产生强度信号我p其中,然后转换成像素触发脉冲 t像素.

     

    一个聪明的解决方案: 使用锁中并提取整个运动

    我们如何可以设计为共振扫描仪控件允许连续缩放和任意数量的像素最多最大的选择?与单向或双向扫描用户的请求吗?在 2000 年由太阳vs森林狼直播 TCS sp2 介绍了稳定、 精确的解决方案。这一概念以来已在系统中与共振扫描仪从徕卡。

    谐振振镜扫描器是扭谐波振荡器。他们在简谐运动的旋转振荡。因此,他们的模式是运动的一个严格的正弦函数。我们需要做的一切是测量的实际相位和振幅的议案中扫描仪,并激励信号进行比较。测量是通过扫描镜后方面上,闪耀的红外二极管。要检测信号,采用位置敏感器件 (PSD)。这是无定形和因此连续的测量设备,与不同的光栅,有大量预定义的元素 (限制测量的分辨率)。从那以后,我们可以通过锁的方法,它允许我们创建一个类似于镜子的真实运动的合成正弦函数提取的确切的振幅和相位。这是可能的因为品质因子 q 谐振振镜是 1000 的范围内。这意味着,系统总是激振荡正弦规律变化的共振频率-偏差是小于 0.1%,即使一个方波的兴奋。共振频率取决于温度和其他环境的参数,但当我们测量频率,我们可以肯定的运行在最佳频率扫描仪。这种方法不是靠对精度的光栅,也不调整和更换这种光栅或其他机械的或光的艾滋病问题。通过高质量测量振幅和振荡器的相位,我们在任何时候都有镜子的位置非常确切的知识。

    现在,在任何时刻了解现场样品中的位置,我们可以将检测到的信号分配给的空间坐标在 x 和 y (和 z)。我们可以自由地分解检测强度 (其中我们连续地测量用高频率采样器),在任意数量的像素为单位) 的火车。那就是: 如果像素的最大数目是例如 1000 每行,我们从理论上讲可以请求任何扫描格式 1 到 1000 之间。

    此外,我们可以决定使用被测的信号对应于 x 扫描的边缘处的像素时间较长。或者,要确保平等的性质来衡量高阶矩像强度的方差的相关性研究,我们可以限制像素长度对整个 x 扫描一个常数。

    当我们衡量和控制幅值,我们可以不断改变字段大小。那就是: 连续缩放,这是不可能与机械格栅的引用。

    如果我们想要移动缩放的区域在显微镜的视野中,我们可以在一个可旋转的设备,允许一个机械的偏移量加上装载的共振扫描仪 (在这里: 在 x 方向)。位置敏感器件和提取的属性与锁在系统仍工作在这些条件,允许我们使用泛函数与共振扫描下的振荡。

    • Position-sensitive diode-based nonlinear pixel clock generator for tunable zoom and free adjustable formats. Realized in Leica TCS SP5 and Leica TCS SP8 confocal and multiphoton scanning microscopes. Also available for TCS SP8 STED and STED 3X instruments.

    图 5: 左: 谐振的扫描共焦与锁在像素时钟解码的示意图。用于成像、 激光通过一个可编程的光声拆分器到扫描镜子上定向和激发荧光样品 (蓝色跟踪) 中。所发出的光 (绿色跟踪) 是由扫描镜 descanned、 由器质性传播和转换成电子信号的探测器。一种辅助的红外二极管被针对扫描镜 (红色跟踪) 的后侧 (还反映)。它到达位置敏感器件 (PSD),它提供了一个信号,表明可以重现完整的扫描镜运动。
    右: 块图的位置控制可调谐像素时钟与共振扫描仪。镜子里的运动是由位置敏感器件 (PSD) 进人锁定放大器监察。在这里,实际运动 (act) 的幅值和相位与励磁信号 (nom) 进行比较。基于 DSP 控制器调整任何偏离了最佳的操作,并提供正确的参数到一个像素时钟???。在这里,从显微镜的发射信号分为空间等距段 (像素时钟)。每个像素的实际积分时间也是可控和可覆盖的完整像素时间 (不同样长的边缘与中心),或修剪世俗地等距测量到的像素积分时间。



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