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    北京pk全天计划连中:徕卡显微镜激光显微切割系统和Qiagen公司试剂盒成功分析RNA

    2018-03-28  发布者:admin 

    激光显微切割(LMD)允许分离单个细胞或染色体,是一个完善的技术通过PCR或测序技术的核酸含量样品制备之前下游分析。在这里,我们描述甚至很少量的徕卡LMD系统和Qiagen公司试剂盒核酸纯化的成功结合。所呈现的工作流程和协议提供成功的LMD应用的基础,而不的核酸量和剩余的RNA的完整性的过程强调产品的高品质中的任何损失。

    材料 - 实验室库存

    徕卡LMD系统

    图1


    • 低温恒温器(如大乐透专家杀号定胆CM1850 UV)

    • 吸取10-1,000微升

    • 吸取2-20微升

    • 离心管

    • 镊子和刷低温恒温器


    材料 - 化学品和消耗品

    Qiagen公司的RNeasy微型试剂盒

    图2

    • 一袋50毫升猎鹰管

    • 纯乙醇(乙醇),分子生物学级

    • 分子生物学级水

    • 甲酚紫

    • 铝箔

    • 0.50.2毫升薄壁PCR管平驾驶室适合LMD阶段收集架

    • 枪头(1 mL固移液管和20微升吸管)

    • 注射用无菌过滤嘴

    • 刀片cryotome

    • 封口膜

    • 徕卡LMD载玻片(如4微米PEN?。?/span>

    • 硅胶袋

    • Kimwipes


    上游的准备

    1%甲酚紫(CV)在100%的乙醇(EtOH)溶液:添加5毫克甲酚紫粉到50ml Falcon试管中,加入100%乙醇以填充50毫升 应准备前1周使用。但在猎鹰冰箱,用铝箔覆盖(甲酚紫对光敏感),摇匀每天平缓。大乐透专家杀号定胆

    用于固定乙醇行洗涤步骤:

    • 2次75%乙醇:填写37.5毫升乙醇到50ml猎鹰管,并添加分子生物学级水至50ml

    • 将一个75%的乙醇猎鹰到-20℃的冰柜

    • 95%乙醇47.5毫升乙醇到50ml猎鹰管,并添加分子生物学级水至50ml

    • 100%的乙醇50毫升EtOH中入50ml Falcon管中

    • 乙醇排在Falcon管可(重新)使用长达3天。

    重要提示:

    • 猎鹰印章用封口膜储存→这将避免乙醇蒸发距离!

    • 放置LMD载玻片10分钟下的UV-C光→acivate膜更好部粘附和消毒的表面!

    • 将0.2或0.5 mL管盖下的UV-C光至少开放30分钟→消毒和消除任何RNA核糖核酸酶和!

    • 准备三五十毫升猎鹰管与一些硅胶袋圆锥→二氧化硅将保持载玻片和部分干燥,RNA工作意味着湿度和水分是你的敌人,因为那些能激活RNA酶!

    Cryosectioning

    与Cryosample地方块分成徕卡低温恒温器直接从-80℃,并让它平衡至少30分钟,在-19℃。

    在图徕卡CM1850紫外线cryotome在-19℃的准备削减3:组织块。


    平衡后制成适当厚度的部分(厚度应选择所关注的细胞的根据直径,此测试10μm的切片制备的)。

    将一个(卷曲)直接从部分到低温0.5毫升管,立即加入350微升RLT缓冲液(Qiagen公司微RNeasy试剂盒的内容)。 这将作为阳性对照的质量和数量。

     

    图4:用冷水镊子收集卷曲部分直接进入无菌管帽。350微升RLT缓冲立即加入到?;NA降解。


       

    图5:部分准备和安装在PEN帧载玻片。将冷冻的部分将容易熔化到它来自室温膜上。


    把与部分进猎鹰用75%EtOH溶液的滑动,在-20℃下进行2分钟(简短固定)。2分钟后短暂风干的载玻片,并将其存储在50毫升猎鹰与圆锥一些硅胶袋(保持干燥)。

    重复此与另一部分和滑动安装,但不是存储通过无菌过滤嘴中添加与所述注射器1%甲酚紫溶液几滴。让关于段1分钟的染色溶液。事后经浸渍滑洗甲酚紫的简要到75%的乙醇,再用95%的乙醇,最后100%的乙醇。 简言之空气干燥的载玻片,并将其存储在50毫升猎鹰与圆锥一些硅胶袋(保持干燥)。

    与另一部分和载玻片重复整个过程。

     

    图6:甲酚紫是通过无菌过滤器覆盖载玻片上的部分为1分钟施加一个注射器。


      

    图7:染色后的洗涤步骤:在滑动浸入升乙醇行以洗掉残留甲酚紫。

    重要提示:

    • 在猎鹰管与圆锥一些硅胶袋商店载玻片和密封的用封口膜→二氧化硅将保持载玻片和部分干燥,密封防止水分环境!


    存储所有管和猎鹰与冰滑梯。 让载玻片平衡15分钟,在室温下旁LMD系统在密封隼先前使用。


    LMD测试滑梯

    你现在应该有:

    • 在管1部分与350微升的RLT缓冲液(阳性对照)

    • 1部安装在滑动和固定用EtOH存储在50ml隼与二氧化硅袋

    • 2载玻片安装固定部分与乙醇,并用CV,存储在50毫升猎鹰用硅胶袋

    图8:缓冲器,管,载玻片猎鹰和75%的乙醇从在冰上冷冻。


    与未染色部分中的滑动被用作另一个控制。 因此,从直接与RLT缓冲膜消化它,并将其转移到0.5毫升管(RLT缓冲总量必须是350微升,消化从载玻片不要使用这一切,因为它会冲洗掉载玻片?。?。

    一个固定的和染色的载玻片被用作另一个控制。 因此,直接从带RLT缓冲膜消化的部分,并将其转移到0.5毫升管(RLT缓冲的总量必须是350微升,不从滑动使用所有它进行消化,因为它会冲洗掉滑动?。?。


    徕卡LMD7000用于RNA分析

    剩余的固定和染色的载玻片被应用于LMD。因此加载在样品架滑动并加载0.5毫升管中的收集架。 选择负载的收集器的位置和使用所希望的倍率标记解剖全部与LMD软件。启动所有的部分被收集到收集管解剖后的激光和控制。 在需要的情况下重新切割部分使用移动+切割,以确保所有收集。

    卸载收集管,小心盖上盖子,并简要降速dissectates。打开盖子,并添加350微升的RLT缓冲液(高达65微升的RLT缓冲液可以添加到集合帽切割前)。

     

    图9:PEN框架具有固定和染色的切片上被装载到LMD系统。


    装入另一收集罩和剖析空膜接近。其中,部分被收集的区域(大致平方微米面积相同的大?。?。 卸载收集管,小心盖上盖子,并简要降速dissectates。 打开盖子,并添加350微升的RLT缓冲液(高达65微升的RLT缓冲液可以添加到集合帽切割前)。 该管将作为LMD阴性对照以后。

    图10:节解剖一块一块的选择放大倍率到无菌管盖。


      

    图11:标记区和解剖结果很容易显现:左切割线,中部,面积解剖,右dissectate在收集管帽。

    重要提示:

    • 多达65微升的RLT缓冲液可直接应用到收集管帽捕获后直接以?;issectate的内容从降解

    图12:用低倍收集Dissectates是用肉眼可看见的(使用5倍的目标实现的例子dissectates的)。


    制备及加工下游激光显微切割

    • 添加44毫升瓶子与RPE和检查乙醇添加的复选框。

    • 制备70%EtOH中的溶液中添加35毫升100%乙醇至50ml隼和添加15毫升分子生物学级水。

    • 制备80%EtOH中的溶液中添加40毫升100%乙醇至50ml隼和加入10 mL分子生物学级水。

    图13:使用Qiagen公司的RNeasy RNA提取轻微的修改协议?微试剂盒使用。


    利用RNA Qiagen公司微套件具有以下略作修改协议的摘录:

    1. 都准备好管。

    1. 加入350微升70%乙醇,每管(在案件移送到合适音量另一管加入350微升70%乙醇前),仔细拌入吸管,直接转移到红离心柱。

    重要提示:

    350微升应分别为100和250μl到不超过0.5毫升管的体积。 混合可以直接在柱来完成。

    1. 旋转15秒,以10000rpm。

    图14:缓冲液被施加到Qiagen公司的RNeasy?旋转柱。


    1. 丢弃通过流并添加350微升RW1洗柱

    2. 旋转15秒,以10000rpm。

    图15:列在离心机蓄势待发。


    1. 丢弃通过流量,列放置到新的2ml管中,并加入500μl的RPE(EtOH中加入之前)洗柱

    2. 旋转15秒,以10000rpm。

    3. 丢弃通过流动,加入500微升80%的乙醇洗柱

    4. 旋转2分钟,在13,000rpm下

    5. 丢弃流过和列放置到新的2ml管中

    6. 旋转5分钟,最大。 速度和盖子打开以干燥塔的二氧化硅膜

    7. 洗脱在14微升水:仔细吸管14微升无RNA酶的水送入塔膜的中部和列放置到一个新鲜和标记的1.5mL管中

    图16:14微升无RNase水轻轻施加到塔的中部,用于对提取的RNA eluation。


    1. 旋转1分钟,在13,000rpm下

    2. 仔细吸管流过回柱膜的中间

    3. 旋转2分钟,在13,000rpm下

    洗脱液应储存在-80℃或如果可能的话立即用于质量和数量的评估。


    快速汇总协议

    示例:

    A - 样品直接从采摘冷冻(整体阳性对照) 
    β - 样品固定,用吸管挑(阳性对照,乙醇固定作用) 
    ? - 样品固定染色,用移液管(阳性对照,乙醇固定和染色的效果)挑 
    e - 样品固定染色,由LMD(LMD的效果)收集 
    ? - 样品采集旁边空膜(阴性对照LMD进程/污染物) 
    F - RLT缓冲阴性对照下游纯化 

    RNA与Qiagen公司微提取试剂盒:

    1. 加入350微升RLT缓冲

    2. 加入350微升70%乙醇,用吸管混合,并直接传输到列

    3. 旋转15秒,10000转

    4. 丢弃流过,并用350微升RW1

    5. 旋转15秒,10000转

    6. 丢弃流过,并用500微升RPE(添加乙醇之前)

    7. 旋转15秒,10000转

    8. 丢弃流过和洗涤用500μl80%的乙醇

    9. 旋转2分钟,10000转

    10. 丢弃流经

    11. 旋转2分钟,最大值 速度盖子打开干燥膜

    12. 在洗脱14微升水*

    13. 自旋1分钟,全速

    14. 使用洗脱液,并把它回柱

    15. 自旋1分钟,全速

    结果

    图17


    RIN?

    28S / 18S 
    (高度)

    28S / 18S 
    (区)

    浓。 
    (纳克/微升)

    样本 
    描述

    警报

    观察

    总RNA区

    rRNA基因区

    A0

    -

    -

    -

    137



    阶梯

    -

    -

    A1

    7.4

    1.4

    1.9

    69.1

    一个



    2.79

    0.61

    B1

    7.1

    1.3

    1.9

    84.5

    B



    3.41

    0.76

    C1

    7.3

    1.4

    2.0

    127

    C



    5.13

    1.26

    D1

    7.2

    1.0

    2.0

    83.6

    D



    3.38

    0.78

    E1

    6.5

    0.4

    0.4

    110

    ?



    4.44

    0.98

    D9

    6.9

    0.7

    0.9

    67.3

    D



    2.68

    0.59

    C2

    -

    -

    -

    7.36

    ?

    !

    RNA浓度外推荐范围为海相

    0.30

    -

    D2

    -

    -

    -

    6.57

    L

    !

    RNA浓度外推荐范围为海相

    0.27

    -

    样品名称

    材料

    日期

    时间

    A260浓度(ng / UL)

    A260(10mm)的

    A280(10mm)的

    A260 / A280

    A260 / A230

    blank_6

    RNA

    2014年12月11日

    ######

    0

    0

    0

    -

    -

    一个

    RNA

    2014年12月11日

    ######

    32.42

    0.81

    0.41

    1.98

    0.13

    B

    RNA

    2014年12月11日

    ######

    48.18

    1.2

    0.58

    2.07

    0.1

    C

    RNA

    2014年12月11日

    ######

    71.01

    1.78

    0.89

    2

    1.51

    D

    RNA

    2014年12月11日

    ######

    48.32

    1.21

    0.54

    2.24

    0.03

    ?

    RNA

    2014年12月11日

    ######

    64.65

    1.62

    0.73

    2.2

    0.06

    D

    RNA

    2014年12月10日

    ######

    41.79

    1.04

    0.47

    2.23

    0.03

    ?

    RNA

    2014年12月11日

    ######

    1.72

    0.04

    0.02

    1.97

    0.02

    L

    RNA

    2014年12月11日

    ######

    0.74

    0.02

    0.01

    2.91

    0.02


    质量

    所有样品(A-D)具有不同的治疗具有几乎相同的质量(RIN 7.1-7.4)。 无影响乙醇固定,染色和徕卡LMD解剖检测。

    低温储存滑动的一个封口膜密封50毫升Falcon管中在-80℃下过夜,在室温下轻轻地解冻分步进行20分钟在-20℃冷冻,20分钟在4℃冰箱和15分钟之前重新打开猎鹰管导致徕卡LMD解剖后类似的结果,以及(样品E1及D9,RIN 6.9和6.5)。

    所有阴性对照空。


    数量

    所有样品(A-D)与不同的治疗方法几乎相同的量,只有样品C(固定,染色,直接拿起从载玻片)显示出较高的数量,然后阳性对照(样品A)。不影响从乙醇固定,染色或徕卡LMD解剖检测。

    低温储存滑动的一个封口膜密封50毫升Falcon管中,在-80℃下过夜,在现有室温轻轻解冻分步进行20分钟在-20℃冷冻,20分钟在4℃冰箱和15分钟重新打开猎鹰管导致徕卡LMD解剖后类似的结果,以及(样品E1和D9,储存后略高的数量)。

    所有阴性对照空。

    测量方法不同导致的测量误差共同不同的结果。


    总之,这些数据清楚地表明,在工作流不影响RNA的质量和数量。


    确认

    我想感谢博士伦道夫Habecker主办的LMD车间。




    沪公网安备 31011202003519号

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